L'aglio cura tumori gravi e incurabili: perché non lo si utilizza per gli esseri umani? (Nature, 2018)
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Una nuova proprietà terapeutica antitumorale dell'estratto di aglio crudo per iniezione ma non per ingestione
Scoperta della morte cellulare 4 , Numero articolo: 108 ( 2018 )
Astratto
Studi precedenti suggeriscono la possibilità che la proprietà antitumorale dell'aglio sia più efficace solo se esposto direttamente alle cellule tumorali piuttosto che assorbito prima dalle normali cellule epiteliali della parete del tratto gastrointestinale. Abbiamo testato questa possibilità in due modelli di tumori maligni altamente aggressivi che non possono ancora essere curati con le terapie convenzionali: il sarcoma 180 e l'ascite letale indotta da EL4. I sondaggi orali giornalieri di estratto di aglio crudo (RGE; equivalente a 100 mg di peso umido) per 21 giorni non hanno offerto alcun effetto significativo nei topi con tumori maligni. Tuttavia, l'iniezione giornaliera delle stesse quantità degli stessi materiali per 21 giorni ha completamente curato tutti i topi dal cancro. Questa nuova attività antitumorale di RGE era presente interamente nella frazione dimensionale delle molecole inferiori a 3000 Dalton piuttosto che nelle molecole più grandi ed era completamente suddivisa nella fase organica piuttosto che nella fase acquosa. Metà dell'attività antitumorale è stata inattivata riscaldando a 100 °C per 10 minuti, suggerendo che più componenti fossero coinvolti in modo concertato. In un confronto diretto, l'RGE è stato significativamente più efficace nell'uccidere le cellule tumorali coltivate in vitro rispetto agli estratti di altre 21 verdure e frutta crude. Nella coltura cellulare, RGE ha ucciso un'ampia varietà di diverse cellule tumorali indipendentemente dalle specie di origine e dai tipi di cellule. Le cellule tumorali generalmente sono ben note per essere difettose in molte vie metaboliche comuni presenti nella loro controparte cellulare normale per l'elaborazione di nutrienti normali. Il metabolismo di questi nutrienti altrimenti normali potrebbe essere bloccato nelle cellule tumorali e diventare citotossico. Il modo più efficace per curare il cancro mediante RGE potrebbe essere l'iniezione diretta invece di mangiare l'aglio cotto.
introduzione
Per diverse migliaia di anni, l'aglio è stato consumato dagli esseri umani non solo come una sorta di alimento aromatizzante, ma anche come alimento medicinale o agente topico. Come alimento medicinale, l'aglio crudo o cotto è stato usato per trattare le infezioni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , per abbassare il colesterolo 8 , 9 , 10 , 11 e per inibire la formazione di coaguli di sangue, ecc. 12 , 13 , 14. Le proprietà antibatteriche dell'aglio furono descritte per la prima volta da Pasteur già nel 1858. Le applicazioni topiche delle paste di aglio crudo furono ampiamente utilizzate come agenti antinfettivi durante la prima e la seconda guerra mondiale dai soldati 15 , 16 . Negli ultimi decenni, le proprietà antitumorali dell'aglio sono state ampiamente studiate anche nelle colture cellulari, negli animali e nell'uomo.
La maggior parte degli studi antitumorali sugli esseri umani consisteva in un'indagine retrospettiva per determinare se esistessero possibili connessioni tra il consumo di aglio cotto e gli episodi di cancro o una progressione più lenta 17 , 18 , 19 , 20 , 21 . Alcuni studi sono stati gli studi di intervento alimentando i soggetti umani con l'aglio. Ma le prove dirette a sostegno di una tesi antitumorale sull'aglio erano deboli 22 , 23 . È stato anche dimostrato che i composti estratti dall'aglio, in particolare i composti solforici, riducono leggermente i tassi di incidenza e la gravità della formazione tumorale indotta dai composti N -nitroso somministrati in modelli animali 24. La visione riduzionista ha portato anche a molti studi sui singoli composti isolati dall'aglio per le loro proprietà antitumorali. Nella maggior parte degli studi sugli animali, quando l'aglio oi suoi composti purificati venivano somministrati per ingestione, gli effetti antitumorali diretti erano al massimo deboli 25 .
Ci sono anche molti studi che suggeriscono che l'aglio può avere proprietà antitumorali dirette nella coltura cellulare. Ad esempio, in un ampio studio su 34 diversi succhi vegetali contro otto diverse linee di cellule tumorali umane, l'estratto di aglio crudo (RGE) quando aggiunto direttamente alle cellule tumorali in coltura si è distinto come l'agente antitumorale più efficace rispetto a tutti gli altri 33 estratti vegetali crudi 26 . Inoltre, questo effetto citotossico era altamente specifico contro le cellule tumorali ma non contro le cellule non cancerose 27 , 28. Questa citotossicità antitumorale altamente selettiva senza danneggiare le cellule normali era anche in accordo con il fatto comunemente noto che l'aglio è un alimento e può essere consumato in sicurezza in grandi quantità senza significativi effetti collaterali negativi. Simili proprietà antitumorali dell'aglio in coltura cellulare sono state riportate anche da altri studi che hanno utilizzato diverse cellule tumorali 29 , 30 . Nonostante gli sforzi degli ultimi decenni, agli effetti antitumorali dell'aglio manca ancora una prova convincente: un risultato decisamente curativo contro il cancro aggressivo nei modelli animali o nell'uomo.
C'è anche un'apparente differenza negli effetti antitumorali quando l'aglio viene cotto o meno ed esposto direttamente alle cellule tumorali o attraversa prima il tratto gastrointestinale (GI). In questo studio utilizzando un paio di modelli di cancro del topo che sono rapidamente letali e non sono stati curati da alcuna terapia convenzionale, abbiamo testato l'ipotesi che l'esposizione diretta di RGE alle cellule tumorali tramite iniezione possa migliorare significativamente il suo effetto antitumorale rispetto all'ingestione in cui esso deve essere assorbito ed elaborato dalle cellule normali.
Risultati
Effetto curativo dell'iniezione ip di RGE contro l'ascite indotta da EL4
EL4 è una linea di cellule di linfoma di topo altamente aggressive che induce ascite rapida e letale nei topi come descritto in precedenza 31 . In questo esperimento, a tutti i topi singenici C57BL/6 è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale (ip) con 2 × 10 6 cellule EL4 dalla coltura cellulare. Ventiquattro ore dopo, i topi iniettati sono stati divisi nei gruppi di iniezione ip di RGE come trattamento e nel gruppo di controllo senza iniezione di RGE. Per il gruppo trattato, a ciascun topo di peso corporeo medio di 15 g è stata somministrata un'iniezione ip di 1 ml di RGE equivalente a 100 mg di peso umido di aglio crudo. Il gruppo di controllo non è stato trattato. L'iniezione ip di RGE è stata ripetuta giornalmente per 21 giorni. Come mostrato in Fig. 1, tutti e otto i topi nel gruppo di controllo, come previsto, hanno sviluppato ascite che ha aumentato il peso corporeo significativamente più in alto rispetto ai topi senza ascite (Fig. 1a ). Lo sviluppo dell'ascite era marcatamente visibile (Fig. 1b, c ). Tutti i topi del gruppo di controllo erano moribondi come indicato nella figura e sono stati uccisi. Tuttavia, i topi sottoposti all'iniezione ip di RGE erano sani senza alcun segno di effetti avversi (Fig. 1b, c). Inoltre, quando l'iniezione di RGE si è interrotta tra i giorni 22 e 37 (o più a lungo fino a quattro settimane, dati non mostrati), i topi sono rimasti sani, indicando che non vi è stata ricrescita di ascite anche molto tempo dopo l'interruzione del trattamento con RGE. Per assicurare che il mancato sviluppo di ascite in questi topi fosse dovuto esclusivamente al trattamento con aglio e non ad altri fattori sconosciuti, il giorno 38 a tutti i topi del gruppo precedentemente trattato con RGE è stata nuovamente somministrata l'iniezione ip di 2 × 10 6 EL4 cellule e lasciato senza l'iniezione di RGE. La ri-sfida con le cellule EL4 ha sviluppato ascite in tutti i topi (Fig. 1a ), indicando che il fallimento dello sviluppo dell'ascite era interamente dovuto al trattamento con RGE.
Dieci topi C57BL6 sono stati inoculati ip con 2 × 10 6 EL4 (cellule di linfoma di ascite di topo). Un giorno dopo, cinque di questi topi sono stati trattati giornalmente con l'iniezione ip di 1 ml di RGE (equivalente a 100 mg di peso umido di aglio crudo) tra il giorno 1 e il giorno 22. Il trattamento è stato interrotto per tutti e cinque i topi tra il giorno 23 e il giorno 22. giorno 37. I topi sono stati iniettati nuovamente con 2 × 10 6 EL4 ip e lasciati non trattati fino alla morte. a L'aumento di peso corporeo in grammi per riflettere lo sviluppo dell'ascite. b Curve di sopravvivenza dei topi in diversi gruppi. c Immagini rappresentative dei topi con e senza ascite
Effetto curativo dell'iniezione ip RGE, non ingestione, contro l'ascite indotta da S180
S180 è un'altra linea di cellule di sarcoma letale aggressivo del topo. Il tempo di sopravvivenza (in media 15 giorni) è stato leggermente più lungo di quello di EL4 (in media 13 giorni) quando le stesse dosi sono state somministrate ip. A tutti i topi è stata somministrata un'iniezione ip con una dose di 2 × 10 6 cellule S180. Un giorno dopo, i topi sono stati divisi in cinque diversi gruppi. Tre gruppi sono stati trattati giornalmente con tre diverse preparazioni di RGE: RGE, la fase acquosa e la fase organica di RGE, ad una dose equivalente a 100 mg del peso originale di aglio crudo umido. A un gruppo è stato somministrato RGE per via orale tramite sonda gastrica con dosi giornaliere equivalenti a 100 mg di peso umido di aglio per ciascun topo. Un gruppo è stato lasciato non trattato come controllo. Come previsto, tutti i topi nel gruppo di controllo hanno sviluppato ascite e sono stati soppressi dopo il moribondo (Fig. 2a, b, c). Allo stesso modo, tutti i topi del gruppo trattato con RGE somministrato tramite sonda gastrica hanno sviluppato ascite senza alcun aumento del tempo di sopravvivenza. Inoltre, anche tutti i topi del gruppo trattato con la fase acquosa di RGE somministrata via ip hanno sviluppato ascite senza alcun aumento significativo del tempo di sopravvivenza. In netto contrasto, quando RGE o la fase organica di RGE è stata somministrata ip alla stessa dose giornaliera per 21 giorni, tutti i topi in questi due gruppi sono rimasti sani senza alcun segno di effetto avverso.
Trentuno topi C57BL6 sono stati inoculati ip con 2 × 10 6 cellule S180 (cellule di sarcoma di topo). Un giorno dopo, a cinque topi è stato somministrato 1 ml di RGE tramite sonda gastrica quotidiana tra il giorno 1 e il giorno 22. Otto topi sono stati trattati con l'iniezione ip di 1 ml di RGE (equivalente a 100 mg di peso umido di aglio crudo) al giorno tra il giorno 1 e giorno 22. Cinque topi sono stati trattati con l'iniezione ip di 1 ml di fase acquosa di RGE (equivalente a 100 mg di peso umido di aglio crudo) al giorno tra il giorno 1 e il giorno 22. Cinque topi sono stati trattati con l'iniezione ip di 1 ml di fase organica di RGE (equivalente a 100 mg di peso umido di aglio crudo) al giorno tra il giorno 1 e il giorno 22. a L'aumento di peso corporeo in grammi per riflettere lo sviluppo di ascite. b Curve di sopravvivenza dei topi in diversi gruppi. CImmagini rappresentative dei topi con e senza ascite
Confronto di RGE con gli estratti di altri frutti e verdure per le loro attività antitumorali
Per confrontare la proprietà antitumorale di RGE, abbiamo preparato estratti di ulteriori sette verdure e 14 frutti in modo simile a quello della preparazione RGE. Tutti i fattori di diluizione sono stati normalizzati ai rispettivi pesi umidi originali. Tutti gli estratti sono stati aggiunti individualmente alle colture cellulari di tre diverse linee cellulari tumorali umane per il confronto diretto: Hela (carcinoma cervicale umano), 5637 (carcinoma vescicale umano) e J82 (adenocarcinoma vescicale umano). Le cellule tumorali sono state placcate al 15% di confluenza e sono cresciute per 24 ore a 37 °C prima che i succhi venissero aggiunti a un fattore di diluizione 1/200 dei rispettivi pesi umidi (5 mg/1 ml). I valori di pH delle soluzioni finali non sono stati influenzati poiché i volumi degli estratti aggiunti erano relativamente piccoli e l'indicatore cromatico del pH del terreno di coltura è rimasto invariato fino alla fine della coltura cellulare. Le cellule sono state co-coltivate per altre 24 ore a 37 °C prima che le cellule vitali in ciascun pozzetto fossero analizzate con il kit CCK-8. Come si vede in Fig. 3 , RGE è stato l'unico che ha ucciso completamente tutte e tre le linee di cellule tumorali. Abbiamo anche testato RGE contro ulteriori cellule tumorali e abbiamo scoperto che era ugualmente efficace nell'uccidere tutte le altre cellule tumorali testate finora, incluse ma non limitate a EL4 e S180 (dati non mostrati). La proprietà antitumorale di RGE era in accordo con il precedente studio su otto linee cellulari tumorali (PC-3, AGS, U-87, DAOY, MCF-7, A-549, Panc-1 e Caki-2) a una concentrazione maggiore (166 mg/ml) 26 . L'RGE si è anche dimostrato altamente efficace nell'uccidere al 100% oltre otto linee di cellule tumorali. Inoltre, gli estratti di cavolfiore, uva rossa, guava e fragola hanno mostrato la stessa efficacia contro le cellule Hela ma un'attività di uccisione molto inferiore contro 5637 e J82 (Fig. 3). RGE aveva proprietà antitumorali più forti contro vari tipi di cellule tumorali nelle colture cellulari rispetto agli estratti di altri ortaggi e frutta testati finora.
Tutti gli estratti di frutta e verdura sono stati preparati nello stesso modo e diluiti in modo simile a 1/200 dei rispettivi pesi umidi (5 mg/ml) per la co-coltura con Hela (carcinoma cervicale umano) e cellule tumorali della vescica umana 5637 e J82. Dopo 24 ore nella condizione di coltura cellulare a 37 ° C, le percentuali di cellule tumorali sopravvissute sono state misurate mediante CCK-8
Frazionamento delle dimensioni dell'attività antitumorale RGE
Per stimare approssimativamente le dimensioni delle molecole attive che coinvolgono la proprietà antitumorale, abbiamo partizionato RGE attraverso un filtro di dimensioni molecolari, attraverso il quale le molecole inferiori a 3000 Dalton sono passate attraverso la membrana e le molecole superiori a 3000 Dalton sono state trattenute nella parte superiore camera del filtro. Dopo la centrifugazione, la maggior parte del colore giallastro e della viscosità rimaneva nella frazione superiore, mentre la frazione inferiore era limpida e non viscosa. Le frazioni sono state riportate ai volumi originari mediante acqua distillata. Le frazioni dimensionali e l'RGE sono state aggiunte alle colture cellulari di cinque diverse linee cellulari tumorali e co-coltivate per 24 ore a 37 °C. Le cellule vitali sono state analizzate dal kit CCK-8. I risultati in Fig. 4mostrano che la proprietà antitumorale della frazione ≤ 3K era quasi identica a quella di RGE a tutte le diluizioni contro tutte e cinque le linee cellulari tumorali. D'altra parte, la proprietà antitumorale era completamente assente dalla frazione ≥ 3 contro le stesse linee cellulari. Inoltre, la diluizione 1/200 (5 mg/ml) sembrava essere una concentrazione critica, attraverso la quale la minor quantità di aglio otteneva il massimo effetto.
RGE è stato frazionato con una membrana filtrante di dimensioni pari a 3000 Dalton cutoff nella frazione inferiore a 3000 Dalton (< 3 K) e nella frazione superiore a 3000 Dalton (> 3 K). Le frazioni sono state co-coltivate con cinque diversi tipi di cellule tumorali a 37 °C per 24 ore alle diluizioni indicate. Le cellule sopravvissute sono state misurate mediante CCK-8
Frazionamento della solubilità dell'attività antitumorale in RGE
Per determinare la solubilità della proprietà antitumorale, abbiamo partizionato RGE nella fase organica e nella fase acquosa tramite estrazione di cloroformio. La fase acquosa è stata riportata al volume originale mediante soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e la fase organica è stata ricostituita al volume originale mediante dimetilsolfossido al 5% (DMSO). Alle diluizioni indicate, le diverse preparazioni RGE sono state co-coltivate individualmente con cinque diverse linee cellulari tumorali per 24 ore. Come mostrato in Fig. 5 , tutte le proprietà antitumorali di RGE erano presenti nella fase organica. Invece di avere la proprietà antitumorale, la fase acquosa di RGE ha persino stimolato la crescita delle cellule di leucemia umana S180 e in particolare K562 di una volta in più rispetto a RGE.
La fase acquosa e la fase organica di RGE sono state preparate come descritto nella sezione dei metodi. Dopo la co-coltura con le frazioni indicate di RGE a 37 °C per 24 ore, le cellule sopravvissute sono state misurate mediante CCK-8
Apoptosi indotta da RGE nelle cellule tumorali
Per esaminare i meccanismi della morte delle cellule tumorali indotte, le cellule S180 dopo essere state trattate con vari preparati RGE sono state esaminate morfologicamente. Dopo il trattamento con RGE o la fase organica, tutte le cellule S180 hanno mostrato la morfologia cellulare e del nucleo altamente condensata, coerente con l'apoptosi (Fig. 6 ). Tuttavia, le cellule S180 trattate con la fase acquosa o il 5% di DMSO non hanno mostrato alcun segno di morte cellulare.
La fase acquosa e la fase organica di RGE sono state preparate come descritto nella sezione metodi. Dopo la co-coltura con le frazioni indicate di RGE a 37 °C per 24 ore, le cellule sono state centrifugate su vetrini, colorate con Diff-Quik ed esaminate e fotografate con microscopio ottico
Inattivazione parziale dell'attività antitumorale RGE mediante calore
Come alimento aromatizzante, l'aglio viene spesso ingerito dopo la cottura. Molti studi sulle proprietà antitumorali sono stati fatti anche con l'aglio cotto. Per determinare la sua sensibilità al calore, abbiamo riscaldato RGE a 100 ° C per 10 min. Come mostrato in Fig. 7 , l'RGE trattato termicamente è stato confrontato con l'RGE non riscaldato per le loro proprietà antitumorali nei confronti di cinque diverse linee di cellule tumorali. Alla diluizione 1/100, il trattamento termico non ha alterato l'attività antitumorale di RGE contro J82 e Hela, ma ha ridotto parzialmente le proprietà antitumorali contro 5637, S180 e K562. Alla diluizione 1/200, le attività di uccisione del cancro contro J82, 5637, Hela e K562 erano per lo più, e contro S180 parzialmente, abolite dal trattamento termico. Questi risultati indicano che alcune attività antitumorali di RGE erano termolabili e altre erano resistenti al calore.
L'RGE riscaldato è stato riscaldato in un blocco riscaldante metallico a 100 ° C per 10 min. Dopo la co-coltura con RGE o RGE riscaldato a 37 ° C per 24 ore, le cellule sopravvissute sono state misurate mediante CCK-8
Elevata uccisione selettiva di RGE contro le cellule tumorali ma non contro le cellule normali
I nostri risultati hanno mostrato che l'RGE iniettato non ha avuto effetti negativi sugli animali trattati, indicando che l'RGE non ha danneggiato le cellule normali. Volevamo verificare ulteriormente questa capacità di RGE di distinguere le cellule tumorali dalle cellule normali nel sistema in vitro. Abbiamo isolato le cellule del nucleo polimorfico umano (PMN) dal sangue di donatori sani. PMN umano e cellule Hela di carcinoma cervicale umano sono state co-coltivate con RGE a diverse diluizioni. A diluizioni 1:400 o superiori di RGE, non vi era alcuna citotossicità specifica contro PMN o Hela (Fig. 8 ). A diluizioni 1:200 o inferiori quasi tutte le cellule Hela sono state uccise e la maggior parte dei PMN era viva. L'apparente selettività contro le cellule in vitro era in accordo con quella dei risultati in vivo dell'RGE iniettato.
La vitalità cellulare nel cancro e nelle cellule normali è stata esaminata mediante saggio CCK-8 dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C con RGE
Discussione
La principale scoperta del nostro studio è che RGE ha avuto un nuovo effetto terapeutico anche contro i modelli più aggressivi di malignità nei topi solo quando iniettato. L'ingestione della stessa quantità di RGE non ha offerto alcun effetto significativo sullo stesso modello di malignità. Questa nuova attività antitumorale nei modelli murini è stata ricapitolata anche nella coltura cellulare in cui l'uccisione diretta delle cellule tumorali da parte di RGE si è distinta molto meglio dell'estratto di qualsiasi altra verdura e frutta. Questa attività ha contribuito ai molteplici composti dell'aglio che erano parzialmente sensibili al calore, organicamente solubili e inferiori a 3000 Dalton. I topi trattati non hanno mostrato alcun effetto collaterale negativo in termini di comportamento e aspetto fisico dal ricevere iniezioni giornaliere di RGE.
Un nuovo aspetto dell'RGE iniettato era la sua capacità di curare i modelli di cancro del topo più aggressivi che non possono essere curati da nessuna terapia convenzionale. Storicamente, ci sono stati due tipi principali di modellazione del cancro nei topi per i test antidroga. Il modello più diffuso consiste nel trapiantare cellule cancerose umane nei topi, per formare noduli visibili e testare gli effetti dei farmaci sulle dimensioni dei noduli. L'altro modello, anche se raramente utilizzato al giorno d'oggi, consisteva nel trapiantare cellule tumorali aggressive che inducono una rapida letalità e nel testare gli effetti degli agenti sulla sopravvivenza dei topi. Finora, non c'è stata alcuna segnalazione di alcuna terapia convenzionale che abbia avuto successo nella cura di questo tipo di malignità del topo indotto e abbia effettivamente salvato i topi dalla morte. I due modelli murini utilizzati in questo studio hanno rappresentato questo secondo tipo di neoplasia con l'estrema aggressività in cui i tempi di sopravvivenza, se trattati senza successo, sono compresi tra 13 e 15 giorni. I topi in questi tipi di tumori maligni sono stati sottoposti a cachessia, emorragie interne e insufficienza dei principali organi che, a differenza del primo modello, rappresentano tutti gli eventi terminali delle morti per cancro umano. Pertanto, la capacità dell'RGE iniettato di uccidere completamente tutte le cellule tumorali senza alcun effetto collaterale negativo nei topi può rappresentare una delle più potenti proprietà antitumorali finora riportate, facendo sperare in significativi effetti benefici se utilizzato nell'uomo. e il fallimento dei principali organi che, a differenza del primo modello, rappresentano tutti gli eventi terminali delle morti per cancro umano. Pertanto, la capacità dell'RGE iniettato di uccidere completamente tutte le cellule tumorali senza alcun effetto collaterale negativo nei topi può rappresentare una delle più potenti proprietà antitumorali finora riportate, facendo sperare in significativi effetti benefici se utilizzato nell'uomo. e il fallimento dei principali organi che, a differenza del primo modello, rappresentano tutti gli eventi terminali delle morti per cancro umano. Pertanto, la capacità dell'RGE iniettato di uccidere completamente tutte le cellule tumorali senza alcun effetto collaterale negativo nei topi può rappresentare una delle più potenti proprietà antitumorali finora riportate, facendo sperare in significativi effetti benefici se utilizzato nell'uomo.
Un altro aspetto sorprendente delle nostre scoperte sono stati gli effetti completamente opposti dell'iniezione di RGE rispetto all'ingestione. Questa nuova scoperta ha dimostrato che l'attività antitumorale estremamente potente di RGE è stata raggiunta solo mediante esposizione diretta alle cellule tumorali ed è stata completamente persa passando prima attraverso il tratto gastrointestinale. Dato che l'aglio è un alimento aromatizzante, si può tranquillamente ragionare sul fatto che tutti i composti dell'aglio sono nutrienti non dannosi per le cellule normali e possono essere assunti anche in grandi quantità dall'uomo senza effetti collaterali negativi. L'ingestione è un processo in cui tutti i nutrienti nel cibo devono essere assorbiti prima nelle cellule epiteliali delle pareti del tratto gastrointestinale. Prima di essere rilasciati nel flusso sanguigno, alcuni nutrienti devono essere processati o modificati metabolicamente nelle cellule epiteliali. Questo processo apparentemente ha distrutto tutte le proprietà antitumorali dell'RGE ingerito oltre alla possibilità che anche gli enzimi digestivi e l'acidità nelle cavità dello stomaco e dell'intestino possano essere distruttivi per l'attività antitumorale. Sebbene molto semplice, la profonda proprietà antitumorale dell'RGE iniettato non è stata riportata in letteratura. Quasi tutti gli studi sull'aglio sono stati condotti con l'aglio ingerito o con iniezioni di composti di aglio isolati individualmente. Tuttavia, l'iniezione di succo di cibi crudi o nutrienti parenterali a pazienti oncologici che sono ancora in grado di mangiare normalmente è raramente praticata in ambito clinico. Il potenziale terapeutico antitumorale dei normali nutrienti di frutta e verdura senza essere prima elaborati dalle cellule epiteliali intestinali potrebbe non essere mai stato testato. Ancora, questo studio ha anche dimostrato che molti altri tipi di frutta e verdura crude avevano proprietà antitumorali significative se esposti direttamente alle cellule tumorali. Pertanto, l'iniezione di succhi di cibi crudi può rappresentare un nuovo concetto di trattamento e può fornire nuove potenzialità terapeutiche rispetto all'ingestione di cibo dopo la cottura.
I nostri risultati hanno anche mostrato che l'uccisione delle cellule tumorali ma non delle cellule normali da parte della RGE era altamente specifica. Questa uccisione selettiva delle cellule tumorali si rifletteva anche nei topi trattati che non presentavano né effetti collaterali fisici visibili né anomalie in alcun organo o tessuto dopo l'autopsia. Questa selettività deve basarsi sulle differenze intrinseche ma comuni tra molte, se non tutte, le cellule tumorali e le cellule normali. È possibile che le cellule tumorali possano acquisire alcune proprietà metaboliche uniche per essere prese di mira in modo univoco dai composti dell'aglio. Ma finora i dati sperimentali sono rari nel sostenere un tale scenario. Sono stati identificati alcuni cambiamenti di guadagno di funzione delle cellule tumorali. Tuttavia, nessuna di queste funzioni modificate era esclusiva delle cellule tumorali poiché anche le cellule normali le hanno solo a livelli leggermente inferiori. Per esempio, tutte le cellule tumorali mostrano una divisione cellulare molto elevata che è condivisa anche da alcune cellule normali. Gli effetti citotossici non selettivi sulle cellule del follicolo pilifero in rapida crescita e sulle cellule epiteliali del tratto gastrointestinale da parte di molti composti chemioterapici sono le ragioni della caduta dei capelli e delle cattive reazioni del tratto gastrointestinale. Per stabilire un tale meccanismo di targeting per guadagno di funzione per la selettività, si deve prima trovare un bersaglio così nuovo che sia presente solo in tutte le cellule tumorali ed è assente in tutte le cellule normali. Finora, nessun marcatore del cancro corrisponde a tutti questi criteri. Per stabilire un tale meccanismo di targeting per guadagno di funzione per la selettività, si deve prima trovare un bersaglio così nuovo che sia presente solo in tutte le cellule tumorali ed è assente in tutte le cellule normali. Finora, nessun marcatore del cancro corrisponde a tutti questi criteri. Per stabilire un tale meccanismo di targeting per guadagno di funzione per la selettività, si deve prima trovare un bersaglio così nuovo che sia presente solo in tutte le cellule tumorali ed è assente in tutte le cellule normali. Finora, nessun marcatore del cancro corrisponde a tutti questi criteri.
Tuttavia, uno scenario opposto per una tale selettività assoluta è altamente fattibile. Vorremmo proporre un possibile meccanismo per spiegare l'uccisione selettiva del cancro. I composti dell'aglio possono prendere di mira uno o più percorsi di perdita di funzione nelle cellule tumorali. In questi casi, i nutrienti che possono essere facilmente elaborati metabolicamente nelle cellule normali non possono essere elaborati nelle cellule tumorali a causa delle loro vie metaboliche difettose. Qualsiasi sostanza nutritiva che può essere assorbita dalle cellule ma non può essere elaborata metabolicamente verrebbe accumulata a livello intracellulare e diventerebbe citotossica. Le cellule tumorali sono ben note per essere le cellule metabolicamente snelle in cui molte vie metaboliche diventano difettose rispetto alle loro controparti cellulari normali. Ad esempio, quasi tutte le cellule tumorali sono difettose nei percorsi correlati alle funzioni dei mitocondri32 , 33 . Inoltre, anche le cellule dell'epatoma di ratto o umano sono difettose nelle vie di metilazione dei lipidi 34 , 35 , 36 .
Anche altre verdure e frutta, come il cavolfiore, l'uva rossa, la guava e la fragola, hanno mostrato proprietà antitumorali simili, ma, a differenza dell'RGE, l'estensione delle loro attività variava da linee di cellule tumorali a linee. Tuttavia, riteniamo che gli estratti di queste verdure e frutta crude possano anche funzionare meglio tramite iniezione che ingestione per le loro attività antitumorali. Finora non vi è alcuna indicazione che queste attività fossero additive quando i diversi estratti sono stati combinati insieme. È anche venuto alla nostra attenzione che RGE prodotto da diverse regioni geologiche può avere diverse potenze di proprietà antitumorali. Non è chiaro se le differenze fossero dovute a differenze nelle sottospecie di aglio o alle qualità del suolo per la crescita dell'aglio. Sembrano necessarie ulteriori indagini.
L'identificazione dei composti attivi in RGE è in corso. Ma può essere complicato dal fatto che l'attività può coinvolgere più composti in modo concertato in RGE. Tuttavia, con o senza l'identificazione preventiva di specifici composti attivi, l'RGE come alimento può essere utilizzato in modo sicuro negli animali e nell'uomo come nutrimento parenterale tramite iniezione endovenosa o ip senza preoccuparsi della citotossicità per le cellule normali. Sebbene i microbi non possano sopravvivere in RGE, è ragionevole filtrare i preparati attraverso i filtri da 0,22 µm per rimuovere eventuali microbi vivi potenziali prima dell'iniezione.
Materiali e metodi
Preparazione di aglio e altri estratti di frutta e verdura
Tutti i 22 tipi di frutta e verdura, compreso l'aglio crudo, sono stati acquistati dal supermercato locale di Winston-Salem, North Carolina, USA. Gli spicchi di aglio fresco crudo o altra frutta e verdura sono stati pesati e mescolati con acqua distillata in un rapporto di 1:9 (grammi:ml) prima di essere frullati alla massima velocità per 3 minuti con un frullatore da cucina Ninja Professional 1100 da 1100 watt . I succhi miscelati sono stati versati attraverso una garza per filtrare i detriti di grandi dimensioni e centrifugati a 500 g a 4 °C per 30 minuti per rimuovere i piccoli detriti producendo estratti chiari. Questi estratti sono stati conservati in aliquote a -80 °C fino a ulteriori utilizzi. Tutti i fattori di diluizione nelle soluzioni finali sono stati calcolati dalle pieghe di diluizione dai pesi bagnati originali dei singoli frutti e ortaggi.
Separazione dimensionale di RGE
Una parte degli estratti di aglio è stata centrifugata attraverso un'unità spin-filter (Amicon Ultra-0,5 ml, 3 k; Millipore) a 14.000 × g per 30 min. Dopo la centrifugazione, sono stati raccolti rispettivamente i filtrati che sono passati attraverso la membrana (la frazione < 3 k) e il fluido che è rimasto al di sopra della membrana (la frazione ≥ 3 k).
Separazione della solubilità di RGE organico
Per la separazione basata sull'idrofobicità, è stato aggiunto a RGE un volume uguale di cloroformio/metanolo (1:1). Dopo un'accurata omogeneizzazione, è stato aggiunto un volume uguale di miscela 1-butanolo/50 mM NaCl (4:5, v/v) prima del vortex e della sonicazione fino a completa miscelazione. Le provette sono state centrifugate in un rotore basculante con 350 × gper 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, l'RGE è stato separato in tre fasi: una fase acquosa superiore incolore; un'interfase solida bianca; e una fase organica inferiore giallo chiaro. La fase acquosa e la fase organica sono state raccolte accuratamente. La fase acquosa è stata essiccata con un leggero flusso di azoto gassoso per rimuovere il metanolo e portata con PBS al volume originale prima della separazione delle fasi. La fase organica è stata completamente essiccata sotto flusso di azoto e portata con DMSO al 5% al volume originario prima della separazione delle fasi.
Linee cellulari
Le cellule di cancro della vescica umana J82 e 5637, la cellula di cancro della cervice umana Hela, la cellula di leucemia mieloide umana K562, la cellula di linfoma muscolare murino EL4 e la cellula di sarcoma murino S180 sono state acquistate dalla American Type Tissue Culture Collection. Le cellule J82 e Hela sono state mantenute in mezzo essenziale minimo con siero bovino fetale al 10% (FBS). Le celle EL4, S180 e K562 sono state mantenute in DMEM con FBS al 10%. 5637 è stato mantenuto in RPMI 1640 con il 10% di FBS. Le colture sono state incubate a 37°C con 5% di CO2 umidificato . I topi C57BL/6 (Charles River Breeding Laboratories) sono stati alloggiati in condizioni controllate (temperatura 25 °C, ciclo di luce 12 ore).
Ascite maligna nei topi
L'ascite maligna è stata indotta nei topi C57BL/6 mediante un'iniezione ip di sospensione cellulare 2 × 10 6 S180 o EL4 in 1 ml di PBS come precedentemente descritto. Ventiquattro ore dopo l'iniezione ip di cellule tumorali (giorno 0), i topi sono stati divisi nei gruppi dei trattamenti progettati e dei controlli non trattati. I topi sono stati ispezionati e pesati giornalmente per la valutazione dello sviluppo dell'ascite. Tutte le procedure di ricerca sugli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
Saggio di citotossicità
Le cellule tumorali sono state seminate nelle piastre a 96 pozzetti fino a circa il 20% di confluenza e sono cresciute per 24 ore a 37 ° C e tutti i gruppi sperimentali sono stati eseguiti in triplicato. Dopo incubazioni con vari succhi e preparazioni per 24 ore a 37 °C, le cellule vitali in ciascun pozzetto sono state determinate utilizzando il Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Enzo Life Sciences) secondo le istruzioni del produttore. In breve, un decimo volume di CCK-8 è stato aggiunto a ciascun pozzetto e incubato per 30 minuti a 37 °C. L'assorbanza a 450 nm è stata misurata in un lettore automatico di micropiastre. Le cellule non trattate sono state utilizzate come controllo per la vitalità cellulare al 100%.
Analisi microscopica della morfologia cellulare
Dopo vari trattamenti con RGE e altri preparati, le cellule S180 sono state raccolte dai pozzetti e citofilate su vetrini e colorate con Protocol Hema-3 (Fisher Diagnostics), una colorazione eosina/ematossilina. La morfologia cellulare è stata analizzata e fotografata al microscopio ottico.
analisi statistica
L'analisi statistica dei risultati è stata eseguita con un test t di Student non accoppiato a due code con un livello di significatività del 5%. Le percentuali di sopravvivenza sono state eseguite con GraphPad Prism versione 5 (GraphPad Software, San Diego, CA.
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Ringraziamenti
Questo progetto è stato sostenuto da un fondo intramurale dal Dipartimento di Patologia, Wake Forest University Health Sciences a ZC. WJL è stato sostenuto da uno stipendio del Dipartimento di Patologia, Scienze della Salute della Wake Forest University come studente di dottorato in visita internazionale e successivamente come borsista post-dottorato. ZML è stato sostenuto da uno stipendio del China Scholarship Council come studente di dottorato in visita internazionale.
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